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Análisis de la actividad antifúngica del duramen de platymiscium pinnatum: tamizaje fitoquímico y potenciales mecanismos de acción de compuestos bioactivos
dc.contributor.author | Chaves Bedoya, Geovanni | |
dc.contributor.author | Ortiz Rojas, luz Yineth | |
dc.contributor.author | Rodas, Elkin Fernando | |
dc.date.accessioned | 2025-05-13T19:56:16Z | |
dc.date.available | 2025-05-13T19:56:16Z | |
dc.date.issued | 2023 | |
dc.identifier.uri | https://repositorio.ufps.edu.co/handle/ufps/9490 | |
dc.description.abstract | La agricultura enfrenta desafíos críticos debido a la presencia de organismos patógenos que comprometen significativamente el desarrollo y la productividad de los cultivos. En este contexto, la utilización de extractos vegetales emerge como una estrategia eco-amigable y sostenible para combatir patógenos, evitando el uso de agentes químicos de origen sintético (Celis et al., 2008). El Peraco o Guayacan trébol (Platymiscium pinnatum), conocido por sus aplicaciones agroforestales e industriales, ha demostrado potencial en la inhibición de microorganismos gracias a sus metabolitos bioactivos (Cuellar et al., 2018). Este proyecto se enfoca en explorar el potencial antifúngico del duramen de P. pinnatum, mediante un tamizaje fitoquímico y la identificación de compuestos mayoritarios por cromatografía de gases acoplada a masas (CG-MS). Subsecuentemente, se evaluará la actividad antifúngica de los extractos derivados de dicho tamizaje, particularmente contra hongos fitopatógenos de prevalencia destacada en Norte de Santander, como Colletotrichum sp. Finalmente, se implementarán métodos computacionales para elucidar los posibles mecanismos de acción de los compuestos bioactivos identificados. Este enfoque permite prever las interacciones entre los metabolitos y las proteínas diana de los patógenos, ofreciendo una perspectiva detallada de los posibles mecanismos de acción antifúngicos que presentan estos compuestos (Shanmugam y Jeon, 2017). La perspectiva holística de este proyectos no solo contribuirá al conocimiento etnobotánico y fitoquímico de P. pinnatum, sino que también abrirá caminos hacia el desarrollo de estrategias antifúngicas basadas en compuestos naturales, alineadas con prácticas agrícolas sostenibles y respetuosas con el medio ambiente. | spa |
dc.description.sponsorship | Fondo de Investigaciones Universitarias - FINU - UFPS. | spa |
dc.format.extent | 50 páginas. Ilustraciones. 510 KB | spa |
dc.format.mimetype | application/pdf | spa |
dc.language.iso | spa | spa |
dc.publisher | Universidad Francisco de Paula Santander | spa |
dc.rights | Derechos Reservados - Universidad Francisco de Paula Santander, 2023 | eng |
dc.rights.uri | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | spa |
dc.title | Análisis de la actividad antifúngica del duramen de platymiscium pinnatum: tamizaje fitoquímico y potenciales mecanismos de acción de compuestos bioactivos | spa |
dc.type | Propuesta de investigación | spa |
dcterms.audience | Comunidad científica colombiana | spa |
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dc.contributor.corporatename | Universidad Francisco de Paula Santander | spa |
dc.contributor.researchgroup | FITOBIOMOL | spa |
dc.contributor.supervisor | Ramirez Leal Pastor | |
dc.coverage.country | Colombia | |
dc.coverage.projectdates | 2024-03-01/2024-12-28 | spa |
dc.description.funder | Mediante la resolución 125 de 24 de mayo de 2011 se reglamenta los criterios y procedimientos para la financiación de los proyectos de investigación a través del Fondo de Investigaciones Universitarias - FINU - UFPS. | spa |
dc.description.methods | METODOLOGIA PROPUESTA 3.1 LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO Y TOMA DE MUESTRAS. El trabajo se realizará en el laboratorio de investigación PLANTAE adscrito a la Facultad de Ciencias Básicas, ubicado en el segundo piso de los laboratorios de Biología de la universidad Francisco de Paula Santander (Lab 201). Material Vegetal. Se trabajara con duramen de Platymiscium pinnatum colectadas en El Triángulo ubicada geográficamente en la vereda Los Peracos corregimiento Buena Esperanza, municipio de san José de Cúcuta, ubicada geográficamente a 7°57'51.3"N 72°29'54.0"W, a 370 m.s.n.m con una temperatura promedio 33 °C y una humedad relativa de 75 %. Para la investigación se utilizarán 300g en peso de duramen de la planta. 3.1.1 Metodología Objetivo 1. Identificar y cuantificar los compuestos bioactivos presentes en el extracto del duramen de Platymiscium pinnatum mediante tamizaje fitoquímico y técnicas de cromatografía de gases acoplada a masas (CG-MS). La siguiente sección detalla la metodología propuesta para alcanzar este objetivo, delineando los pasos específicos, técnicas y consideraciones analíticas que guiarán esta exploración fitoquímica. Obtención de extractos. Se emplearán 100 gramos de duramen, previamente secado y desprovisto de polvo, sometiéndolo a una extracción con 600g de etanol (Merck KGaA). La mezcla se agitará durante 72 horas en condiciones de oscuridad, utilizando un agitador 16 SHAKER (MAXQ 4450) a 35°C y una velocidad de 100 rpm. A continuación, el extracto resultante se filtrará mediante técnica al vacío, utilizando papel filtro (Qual. dia. 125mm, BOECO GERMANY) y una bomba de vacío (MEDI-PUMP 33,8” DE MERCURIO DOSIVAC). Posteriormente, el extracto etanólico se concentrará bajo presión reducida utilizando un ROTAVAPOR IKA® RV 10 CONTROL, operando a 50 rpm, 150 mbar y 40°C. El extracto concentrado se almacenará en frascos ámbar y se mantendrá a una temperatura de 4oC hasta que se realicen los análisis correspondientes para la caracterización fitoquímica preliminar. Marcha fitoquímica. Tras la obtención de los extractos etanólicos del duramen de Platymiscium pinnatum (Jacq) Dugand, estos se someterán a una marcha fitoquímica preliminar, la cual se llevará a cabo en el Laboratorio de Investigación FITOBIOMOL, adscrito a la Facultad de Ciencias Básicas. La metodología empleada será la descrita por Nicolas Sharapin (2000), que permite identificar los principales grupos de metabolitos secundarios, ya sea en su forma libre o como glucósidos, mediante el desarrollo de reacciones que producen cambios de color y precipitados. Cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Se preparará un extracto del duramen de Platymiscium pinnatum (Jacq) Dugand utilizando metanol de calidad HPLC al 80%. Tras la obtención del extracto, este será filtrado y sometido a concentración bajo presión reducida para asegurar la eliminación de solvente residual y preservar los compuestos de interés. El concentrado resultante se ajustará a un volumen de 5 mL, seguido de un filtrado para eliminar posibles impurezas (filtro de 45 μm). Dicho extracto se almacenará en un frasco ámbar, garantizando su estabilidad y protegiéndolo de la degradación por exposición a la luz, hasta su análisis posterior. El análisis mediante Cromatografía de Gases Acoplada a Masas se realizará en el Laboratorio de Análisis Instrumental de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Este procedimiento no solo permitirá la identificación de los compuestos presentes en el extracto sino que también proporcionará información valiosa sobre la estructura molecular de los metabolitos secundarios presentes en el duramen de P. pinnatum. La metodología específica para el análisis GC-MS, incluyendo parámetros de operación del instrumento y condiciones de análisis, se establecerá basándose en protocolos estandarizados y literatura científica relevante, asegurando así la obtención de datos fiables y reproducibles. 17 3.1.2 Metodología Objetivo 2. Evaluar la eficacia antifúngica de los compuestos bioactivos identificados en el duramen de Platymiscium pinnatum contra hongos fitopatógenos de prevalencia en Norte de Santander mediante ensayos in vitro. La implementación de ensayos antifúngicos in vitro permitirá una evaluación controlada y precisa de la actividad antifúngica, proporcionando datos cruciales sobre la potencia y espectro de actividad de los compuestos en estudio. La metodología detallada para la realización de estos ensayos y la posterior interpretación de los resultados se describirá en las siguientes secciones, estableciendo un marco para la exploración sistemática y la validación de la actividad antifúngica de los compuestos derivados de P. pinnatum. Prueba de difusión en disco. Para la evaluación de la actividad antifúngica del duramen de Platymiscium pinnatum (Jacq) Dugand, se determinará siguiendo el método de Antibiograma de diluciones del extracto concentrado, utilizando la técnica Kirby-Bauer estándar para la realización de las pruebas de sensibilidad por difusión en agar con sensidiscos. Se tomará alícuotas (mL) del extracto concentrado del duramen de Platymiscium pinnatum para preparar diluciones a 1:1, 1:2, 1:3, y 1:4 (extracto:etanol). Se impregnan sensidiscos con las diluciones y el extracto concentrado para la evaluación de su actividad antifúngica contra el hongo Colletotrichum sp. Para los controles positivos se trabajará con una concentración 4 mg/mL de Mancozeb para el hongo y como control negativo se utilizará agua y alcohol. Análisis estadístico. La parte experimental cuantitativa de los bioensayos se llevarán a un análisis estadístico por medio de la prueba ANOVA (análisis de varianza) y la comparación de medias de Tukey con el programa estadístico XLSTATS 2023. Los tratamientos que se serán utilizados en el estudio se presentan en la Tabla 2. Cada tratamiento se realizará por triplicado. 18 Tabla 2. Tratamientos utilizados en la evaluación de los extractos TRATAMIENTO NOMBRE TRATAMIENTO 1 Control positivo 2 Control negativo (OH) 3 Control negativo (H2O) 4 Extracto concentrado 5 Dilución 1:1 6 Dilución 1:2 7 Dilución 1:3 8 Dilución 1:4 3.1.3 Metodología Objetivo 3. Aplicar técnicas bioinformáticas para elucidar los posibles mecanismos de acción de los compuestos bioactivos identificados y sus posibles interacciones con proteínas diana en los hongos fitopatógenos. La elucidación de los posibles mecanismos de acción entre las dianas biológicas de los hongos fitopatógenos y los biocompuestos con actividad antifúngica derivados del duramen de Platymiscium pinnatum nos brinda información crucial sobre su potencial terapéutico y su influencia en los procesos biológicos. Este conocimiento nos permite avanzar en el desarrollo de enfoques innovadores y sostenibles para el control de enfermedades en los cultivos agrícolas. A continuación, se describe la metodología necesaria para llevar a cabo este objetivo. 19 Identificación de potenciales blancos terapéuticos en hongos fipatógenos susceptibles a compuestos bioactivos de extractos de P. pinnatum. La exploración de dianas terapéuticas en hongos fitopatógenos susceptibles a compuestos de P. pinnatum se efectuará mediante acoplamiento molecular reverso, utilizando el programa PharmMapper (https://www.lilab- ecust.cn/pharmmapper/). Tras la caracterización de los compuestos bioactivos del extracto mediante espectrometría de masas y cromatografía de gases, sus estructuras químicas se optimizarán para análisis in silico, asegurando conformaciones tridimensionales y propiedades químicas adecuadas. El acoplamiento con PharmMapper, compara los compuestos contra un repositorio de sitios de unión farmacológicos, identificará posibles dianas, clasificándolas por un score de complementariedad (Wang et al., 2017). Las dianas sugeridas se validarán explorando literatura y bases de datos para corroborar las interacciones predichas y se identificarán en los hongos mediante el software BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Una vez identificadas las dianas (proteínas) se descargarán sus secuencias primarias de aminoácidos en formato fasta para realizar posteriores análisis. Simulación de la estructura tridimensional (3D) de las dianas terapéuticas identificadas en hongos fitopatógenos. Inicialmente se verificará si las estructuras 3D de las dianas terapéuticas identificadas en hongos fitopatógenos han sido elucidades experimentalmente, y por tanto sus estructuras se encuentran disponibles en el PDB - Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Una vez identificadas en el PDB, se descargarán sus estructuras y se utilizarán para los respectivos análisis. De lo contrario, se utilizarán el servidor de modelado de proteínas de Alphafold 2 (https://swissmodel.expasy.org/) para realizar la simulación de la estructura 3D a partir de la secuencia primaria (formato fasta) de las dianas terapéuticas identificadas por acoplamiento molecular reverso. Esta es una plataforma gratuita y accesible para el plegamiento de proteínas basado en inteligencia artificial (Mirdita et al., 2022). Todas las estructuras 3D serán visualizadas en los programas Pymol (https://pymol.org/2/). Validación de la calidad de los modelos 3D de las dianas terapéuticas identificadas en los hongos fitopatógenos. La calidad estructural y estereoquímica de los modelos 3D de 20 las dianas terapéuticas identificadas en los hongos fitopatógenos se validará mediante el uso de los programas PROCHECK, ERRAT y Verify3D (https://saves.mbi.ucla.edu/). Determinación del sitio de unión a ligandos y potencial farmacológico de las dianas terapéuticas identificadas. Se utilizarán la plataforma web PROTEIN PLUS (https://proteins.plus) y la herramienta DoGSiteScorer para identificar los posibles sitios de unión de los biocompuestos derivados del duramen de Platymiscium pinnatum. DoGSiteScorer es software basado en cuadrículas que emplea un filtro de diferencia de Gauss para detectar bolsillos de unión potenciales utilizando únicamente la estructura tridimensional de la proteína. Estos bolsillos se dividen en sub-bolsillos para un análisis más detallado (Volkamer et al., 2012). Para determinar las coordenadas del sitio catalítico de la diana terapéutica (proteína o enzima), se utilizará el programa de visualización gráfica UCSF CHIMERA (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). Estructura tridimensional (3D) de los biocompuestos derivados de Platymiscium pinnatum. Las estructuras 3D de los compuestos derivados de P. pinnatum con actividad biocida contra hongos fitopatógenos serán obtenidos a partir de bases de datos como ZINC (https://www.google.com/search?client=safari&rls=en&q=ZINC+database&ie=UTF- 8&oe=UTF-8), PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) o ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/). Cuando sea necesario las estructuras 3D de los biocompuestos serán minimizados utilizando el programa Avogadro (Hanwell et. Al., 2012). La interconversión de formatos será realizada utilizando el software de código abierto Opeen Babel (O'Boyle et.al., 2011). Acoplamiento molecular (Docking molecular). Las estructuras en formato PDB de las dianas terapéuticas serán sometidas a un acoplamiento molecular (Docking molecular) con los biocompuestos que han mostrado actividad antifúngica. Las coordenadas del sitio de unión a ligandos en las dianas terapéuticas serán utilizadas para guiar la interacción de los biocompuestos con las proteínas utilizando el software AutoDock Vina (Trott et al., 2010). AutoDock Vina se especializa en la búsqueda conformacional basada en gradientes 21 utilizando la estructura 3D de las dianas terapéuticas. La energía de unión de los complejos proteína-ligando será expresada en Kcal/mol (Trott et al., 2010). Para la identificación de las posibles interacciones proteína-ligando, se emplearán la plataforma web PROTEIN PLUS (https://proteins.plus) y la herramienta PoseView 2D presente en este mismo sitio WEB. Dinámica molecular de los complejos proteina-ligando. Para analizar la estabilidad de los complejos proteína-ligando en función del tiempo se llevarán a cabo las simulaciones de dinámica molecular empleando el software NAMD (Phillips et al., 2005). Este programa, diseñado para la simulación con el campo de fuerza CHARMM36 (Brooks et al., 1983). Los parámetros del campo de fuerza CHARMM36 se obtendrán utilizando el software CGenFF (CHARMM General Force Field). Durante las simulaciones, se utilizará el conjunto de condiciones de colectivo isobárico-isotérmico (NPT) y condiciones periódicas de contorno (Feller et al., 1995). Para mantener la presión y la temperatura constantes, se aplicará el método de Nosé-Hoover. Las interacciones electrostáticas se calcularán dentro de un radio de corte de 12 Å (Jang et al., 2004), y los efectos electrostáticos a largo alcance se tendrán en cuenta mediante el método PME (Particle Mesh Ewald) (Essmann et al., 1995). Antes de la dinámica molecular, los complejos proteína-ligando se someterá a una minimización durante 100 ps a 305 K para alcanzar un estado más estable. A continuación, se realizará una simulación de dinámica de 100 ns. Los resultados obtenidos se visualizarán utilizando el programa VMD, una herramienta de gráficos moleculares diseñada específicamente para la visualización y análisis de conjuntos moleculares (Humphrey, Dalke y Schulten, 1996). | spa |
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