Tipificación molecular del hla b* 27 mediana y alta resolución mediante pcr-ssp.

Abstract

En el presente trabajo se estandarizó el protocolo para la tipificación del alelo HLA B*27 por medio de la técnica de PCR-SSP en mediana resolución e identificación en alta resolución de algunos de los subtipos más representativos. Durante el transcurso del proyecto se evaluaron, analizaron y diseñaron los cebadores y mezclas por medio de herramientas bioinformáticas como UGENE, AmplifX y base de datos como IPD-IMGT/HLA, NCBI, OligoAnalyzer y dbMHC. Para la estandarización del protocolo se diseñaron 17 mezclas formadas por 28 cebadores de los cuales 2 fueron tomados de bibliografía y 4 fueron diseñados por bioinformática, los demás cebadores son utilizados para la tipificación completa del locus B e identificados como específicos para el alelo B*27. Todas las mezclas fueron evaluadas por medio de ensayos in Silico y para el diseño del ciclo térmico se tomaron en cuenta parámetros como la Temperaturas Melting y el %GC de los cebadores. La lectura del producto de PCR se realizó por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio como agente intercalante. Los ADN fueron muestra guardas en el laboratorio como control positivo de anteriores trabajos y muestras remitidas al laboratorio para tipificación HLA completa o locus especifico durante el periodo del proyecto. En total se tipificaron molecularmente 30 muestras en mediana resolución es decir solo el diagnostico positivo o negativo para este alelo de las cuales 11 fueron tipificadas en alta resolución encontrando los subtipos B*27:02, B*27:03, B*27 05 y B*27:07. Tipificación certificada y comparada con el kit comercial de OlerupSSP alta resolución B*27.